Nā huahana
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR kit ʻike no ka 2019-nCoV
Hoʻohana i manaʻo ʻia
Hoʻohana ʻia kēia kit no ka ʻike qualitative o ka coronavirus hou (2019-nCoV) me ka hoʻohana ʻana i ka ʻāʻī ʻāʻī, nā nasopharyngeal swabs, bronchoalveolar lavage fluid, sputum. hōʻike no ka maʻi maʻi a me ka mālama ʻana. ʻO ka loiloi piha ʻana o ka maʻi i ʻōlelo ʻia me ka hui pū ʻana me nā hōʻike hōʻike o ka mea maʻi a me nā hoʻokolohua ʻē aʻe.
Kumukānāwai nānā
Hoʻokumu ʻia ka pahu i ka ʻenehana RT-PCR hoʻokahi.ʻO ka ʻoiaʻiʻo, ua koho ʻia ka 2019 coronavirus hou (2019-nCoV) ORF1ab a me N genes ma ke ʻano o ka amplification target regions.Hoʻolālā ʻia nā kumu mua a me nā ʻimi fluorescent (N gene probes me FAM a me ORF1ab probes me HEX) i hoʻolālā ʻia e ʻike i ka 2019 hou-type coronavirus RNA i nā laʻana.Aia i loko o ka pahu kahi ʻōnaehana ʻike mana kūloko endogenous (internal control gene probe labeled me CY5) e nānā i ke kaʻina o ka hōʻiliʻili laʻana, RNA a me PCR hoʻonui, a laila e hōʻemi i nā hopena maikaʻi ʻole.
Nā mea nui
| Nā ʻāpana | Volume（48T/Kiki） |
| ʻO ka hoʻonā ʻana o ka RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture（ORF1ab,N Gene, RnaseP Gene） | 864µl |
| Manaʻo ʻino | 1500µl |
| Kūʻē maikaʻi nCOV (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
Nā mea hoʻopaneʻe ponoʻī: RNA unuhi a hoʻomaʻemaʻe reagents.Manaʻo maikaʻi ʻole: ʻO ka mana maikaʻi ʻo RNA i loko o ka ʻāpana i hoʻopaʻa ʻia, aʻo ka mana maikaʻi ʻole ʻo ia ka wai nucleic acid-free.I ka wā o ka hoʻohana ʻana, pono lākou e komo i ka unuhi ʻana a pono e manaʻo ʻia he maʻi maʻi.Pono e mālama ʻia a hoʻopau ʻia e like me nā lula pili.
ʻO ka gene reference i loko ka gene RnaseP kanaka.
Nā kūlana mālama a me ka lā pau
-20 ± 5 ℃, pale i ka hoʻoheheʻe pinepine ʻana a me ka hoʻoheheʻe ʻana ma mua o 5 mau manawa, kūpono no 6 mau mahina.
Mea hana pili
Me FAM / HEX / CY5 a me nā mea hana PCR fluorescent multi-channel.
Nā koi hoʻohālike
1. Nā ʻano kikoʻī e pili ana: nā ʻāʻī ʻāʻī, nā nasopharyngeal swabs, bronchoalveolar lavage fluid, sputum.
2. ʻOhi hōʻiliʻili (aseptic technique)
Pharyngeal swab: E holoi i nā tonsils a me ka paia pharyngeal hope me ʻelua mau pulupulu i ka manawa like, a laila e hoʻokomo i ke poʻo swab i loko o kahi paipu hoʻāʻo i loaʻa ka hopena laʻana.
Sputum: Ma hope o ka loaʻa ʻana o ka ʻū hohonu o ka mea maʻi, e hōʻiliʻili i ka sputum i hoʻopaʻa ʻia i loko o kahi paipu hoʻāʻo ʻo ka pāpale wili e loaʻa ai ka sampling solution;ka wai holoi bronchoalveolar: Ka laʻana e nā ʻoihana lapaʻau.3.Storage a me ka lawe ʻana i nā laʻana
Pono e ho'āʻo koke ʻia nā mea hoʻohālike no ka hoʻokaʻawale ʻana i ka maʻi virus a me ka hoʻāʻo RNA.Hiki ke mālama ʻia nā hiʻohiʻona i ʻike ʻia i loko o 24 mau hola ma 4 ℃;nā mea hiki ʻole ke ʻike ʻia i loko o 24
Pono e mālama ʻia nā hola ma -70 ℃ a i ʻole ma lalo (inā ʻaʻohe kūlana mālama o -70 ℃, pono lākou
mālama ʻia no ka manawa ma -20 ℃ refrigerator).Pono nā mea hoʻohālike e pale i ka maloʻo a me ka hoʻoheheʻe ʻana i ka wā o ka lawe ʻana.Pono e hoʻouna koke ʻia nā mea hoʻohālike i ka hale hana ma hope o ka hōʻiliʻili ʻana.Inā pono e lawe ʻia nā laʻana ma kahi lōʻihi, ʻoi aku ka mālama ʻana i ka hau maloʻo.
Nā ʻano hoʻāʻo
1 Ka hana laʻana a me ka unuhi ʻana i ka RNA (wahi hana laʻana)
Manaʻo ʻia e lawe i 200μl o ka hāpana wai no ka unuhi ʻana o RNA.No nā ʻanuʻu unuhi pili, e nānā i nā ʻōlelo aʻoaʻo o nā pahu hoʻoheheʻe RNA kālepa.ʻO nā meaʻino a me nā meaʻino
ua komo nā mana i loko o kēia kit i ka unuhi ʻana.
2 PCR hoʻomākaukau reagent (wahi hoʻomākaukau reagent)
2.1 Wehe i nā ʻāpana a pau mai ka pahu a hoʻoheheʻe ʻia a hui pū me ka lumi wela.Centrifuge ma 8,000 rpm no kekahi mau kekona ma mua o ka hoʻohana ʻana;E helu i ka nui o nā reagents i makemake ʻia, a ua hoʻomākaukau ʻia ka ʻōnaehana pane e like me ka mea i hōʻike ʻia ma ka papa aʻe.
| Nā ʻāpana | N lawelawe (25µl pūnaewele) |
| nCOV primer TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| ʻO ka hoʻonā ʻana o ka RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = ka helu o nā laʻana i hoʻāʻo ʻia + 1 (ka mana ʻino) + 1 (nCOVmana maikaʻi) | |
2.2 Ma hope o ka hui pono ʻana i nā ʻāpana, centrifuge no ka manawa pōkole e hoʻokuʻu i ka wai a pau ma ka paia o ka paipu e hāʻule i lalo o ka paipu, a laila aliquot i ka ʻōnaehana amplification 20 µl i loko o ka paipu PCR.
3 Ka laʻana (wahi hoʻomākaukau hoʻohālike)
E hoʻohui i 5μl o nā mana maikaʻi ʻole a maikaʻi ma hope o ka unuhi ʻana.Hoʻohui ʻia ka RNA o ka laʻana e hoʻāʻo ʻia i ka paipu hopena PCR.
E hoʻopaʻa paʻa i ka paipu a me ka centrifuge ma 8,000 rpm no kekahi mau kekona ma mua o ka hoʻoneʻe ʻana i ka wahi ʻike hoʻonui.
4 PCR hoʻonui (amplified detection area)
4.1 E kau i ka paipu hopena i loko o ke keena hāpana o ka mea kani, a e hoʻonoho i nā ʻāpana penei:
| kahua | Kaapuni helu | Mahana(°C) | Manawa | hōʻiliʻilipaena |
| Hulipalapala kākau | 1 | 42 | 10 min | - |
| Pre-denaturationn | 1 | 95 | 1min | - |
| Kaapuni | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | ʻohi ʻikepili |
Ke koho ʻana i ke ala ʻike mea kani: E koho i ke kahawai FAM, HEX, CY5 no ka hōʻailona fluorescence.No ka hōʻike ʻana i ka fluorescent NONE, mai koho iā ROX.
5 Ka nānā 'ana i ka hopena (E 'olu'olu e nānā i nā kuhikuhi ho'okolohua o kēlā me kēia mea hana no ka ho'onohonoho)
Ma hope o ka hopena, mālama i nā hopena.Ma hope o ka nānā ʻana, e hoʻoponopono i ka waiwai hoʻomaka, ka waiwai hoʻopau, a me ka waiwai paepae o ka baseline e like me ke kiʻi (hiki i ka mea hoʻohana ke hoʻololi e like me ke kūlana maoli, hiki ke hoʻonohonoho ʻia ka waiwai hoʻomaka i 3 ~ 15, hiki ke hoʻonohonoho i ka waiwai hope i 5 ~ 20, hoʻoponopono) i ka pakuhi logarithmic Ma ka paepae o ka puka makani, aia ka laina paepae ma ka māhele logarithmic, aʻo ka kaha hoʻonui o ka mana maikaʻiʻole he laina pololei a ma lalo paha o ka laina paepae).
6 Ka mana quauty（Hoʻokomo ʻia kahi mana kaʻina hana i ka hoʻāʻo) Manaʻo maikaʻi ʻole: ʻAʻohe pihi hoʻonui ʻike ʻia no nā ala ʻike FAM, HEX, CY5.
ʻO ka mana maikaʻi o COV: ka pihi hoʻonui ʻike ʻia o nā ala ʻike FAM a me HEX, Ct value≤32, akā ʻaʻohe pihi hoʻonui o ke kahawai CY5;
Pono e hoʻokō ʻia nā koi i luna i ka manawa like i ka hoʻokolohua like;a i ʻole, ʻaʻole kūpono ka hoʻokolohua a pono e hana hou ʻia.
7 Hoʻoholo i nā hopena.
7.1 Inā ʻaʻohe pihi hoʻonui a i ʻole ka waiwai Ct> 40 ma nā kaha FAM a me HEX o ka laʻana hoʻāʻo, a aia kahi pihi hoʻonui ma ke kahawai CY5, hiki ke hoʻoholo ʻia ʻaʻohe 2019 hou coronavirus (2019-nCoV) RNA i ka hāpana;
.2 Inā loaʻa i ka hāpana hoʻāʻo nā pihi hoʻonui i ka FAM a me ka HEX, a ʻo ka waiwai Ct he ≤40, hiki ke hoʻoholo ʻia he maikaʻi ka hāpana no ka coronavirus hou 2019 (2019-nCoV).
7.3 Inā loaʻa i ka hāpana hoʻāʻo kahi pihi hoʻonui maʻemaʻe wale nō i hoʻokahi kahawai o FAM a i ʻole HEX, a ʻo ka waiwai Ct ʻo ≤40, a ʻaʻohe pihi hoʻonui ma ke kahawai ʻē aʻe, pono e hoʻāʻo hou ʻia nā hopena.Inā kūlike nā hopena hoʻāʻo hou, hiki ke hoʻoholo ʻia ka hāpana no ka mea hou
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Inā maikaʻi ʻole ka hopena o ka hoʻāʻo hou ʻana, hiki ke hoʻoholo ʻia he maikaʻi ʻole ka hāpana no 2019 hou coronavirus (2019-nCoV).
Waiwai hoʻoholo maikaʻi
Hoʻohana ʻia ke ʻano kaila ROC no ka hoʻoholo ʻana i ka waiwai CT kuhikuhi o ka kit a ʻo ka waiwai kuhikuhi mana kūloko ʻo 40.
Ka wehewehe ʻana i nā hopena hoʻāʻo
1. Pono e ho'āʻoʻia kēlā me kēia hoʻokolohua no nā mana maikaʻiʻole a maikaʻi.Hiki ke hoʻoholo ʻia nā hopena hoʻāʻo inā hoʻokō nā mana i nā koi hoʻomalu maikaʻi
2. Ke maikaʻi ka FAM a me ka HEX ʻike ʻana, ʻo ka hopena mai ke kahawai CY5 (ka hoʻokele mana o loko) hiki ʻole ke hoʻokūkū ma muli o ka hoʻokūkū ʻōnaehana.
3. I ka hopena o ka mana kūloko, inā ʻaʻole maikaʻi ka pahu hoʻāʻo FAM a me ka HEX ʻike ala, ʻo ia hoʻi ua pio ka ʻōnaehana a i ʻole ka hana hewa ʻana, ʻaʻole pono ka hoʻāʻo.No laila, pono e ho'āʻo hou i nā laʻana.
